ames試験: サルモネラ菌の表記について

10年以上ブログ書いてないのでよくわかりません >< たぶん10年以上前の、細かい話です。

 

Ames試験は、化学物質等が微生物に突然変異を起こすかどうかをを検査する最も汎用される試験法です。Amesさんが開発した試験法で、発がん性のスクリーニングとして用いられています。農薬、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品添加物、食品容器、、あとなんだろう?様々な分野で用いられます。

 

試験としては、特定のアミノ酸が存在しないと増殖できない微生物を使って、その特定のアミノ酸が無い培地と化学物質(等)といっしょに培養するんです。普通なら増殖できないはずなのです。でも突然変異を起こすことができた微生物は、増殖できることがあるんです。すごい!進化した!突然変異か!

 

んで、化学物質を加えたものと加えないものを比較して、化学物質を加えたもののコロニーが二倍以上あったら、これは化学物質が突然変異を誘発したかもわからんね→変異原性の疑い? となるわけです。

 

サルモネラ菌の場合は、ヒスチジンが無いと増殖できない、大腸菌の場合はトリプトファンが無いと増殖できない微生物がよく使用されます(酵素を加えるなどいちいち細かい説明しません)。

 

使用されるのがサルモネラ菌の中のネズミチフス菌です。

種はイタリックで書くお約束なので、ネズミチフス菌は 歴史的にはSalmonella Typhimurium だったのですが、変遷もあって、Typhimuriumは種じゃなくて血清型だからイタリックで書くのおかしいよね? ということで、Typhimuriumのイタリック表記をやめました。 
Salmonella enterica
subsp. enterica serovar TyphimuriumTとなりました。

省略名称はSalmonella Typhimurium で Typhimuriumはイタリックではなく立体です。そういうことになりました。

 

わかってない人も多くて、食品安全委員会の委員が Salmonella Typhimurium の Typhimuriumが立体なのはおかしい、違和感がある、などと言いだしたこともありました。(ソースは出しませんが議事録はあります)。委員の言うことで反対は無かったのでその後も Salmonella Typhimurium で通ったんですけど、Salmonella Typhimuriumで資料を提出した、事務局は相当優秀だと思いました。私はちゃんと見てたよ!見てたよ!事務局の人優秀!応援してる!

 

当時でも EFSA Journal (欧州食品安全機関) では普通にSalmonella Typhimurium の表記を使ってたんで、感度高い人は普通に知ってたんです。食品安全委員会の委員がEFSA Journal読んでないことなんてある?文句が一つもでない!?さぼりすぎでは。昔のガイドラインだと普通にイタリック表記ですが、みんなわかってて修正に手間かけない選択なのかな。今でも普通に Salmonella Typhimurium などと書いてるのときどき見るとこいつまじかって思います。用語にこだわるのはADHDとか言われるけど、科学に携わるなら用語はちゃんとしよう

 

なんかフォントが途中から変わってる?はてなブログよくわかりません><

化学系のかくし芸:指マッチ

※大変危険ですので、指マッチを行う際は経験者の指導の下に行って下さい。

化学系の隠し芸の一つに、指マッチというものがあります。(http://www.catvy.ne.jp/~sig/experiments/exp_03_1.html など。)指をマッチに見立てて指先に火を灯してみせるという技ですが、うまくやれば全く熱くありません。一般的には、以下の手順で行われるようです。

  • 指を一本、水に十分ひたす。
  • 軽く水を切り、エタノールなどの有機溶媒を指先につける。
  • 着火し、指をまっすぐ上に向ける。

指を上に向けるのがポイントで、上に向けていないと立ち上る炎で熱いかもしれません。指が熱くない理由については水の膜があるだとか蒸発潜熱だとかの説明がなされているようです。

これはこれで面白いのですが、もっと派手な方法がないものでしょうか。あまり紹介されていないようなので、ここでは、学生時代にいろいろ試してみた拡張版指マッチの数々をご紹介します。全て実演経験済みで、可能なことは確認しています。


1)水を使わない指マッチ
実演する際、二種類の液につけるよりも一回で済むほうがシンプルで見栄えがします。そこで、指を水にひたす、という工程を飛ばします。有機溶媒として、メタノールを使うだけです。

  • メタノールを指につける(メタノールをビーカーにとって、指をずぼっと漬ける感じで)
  • 着火し、指をまっすぐ上に向ける

意外にも、熱くありません。メタノールの燃焼熱および蒸発潜熱は、ちょうど水とエタノールの中間あたりに位置します。水/エタノール系でうまく行くのであればメタノールでうまく行ってもおかしくありません(事実、うまくいきました)。メタノールではなく、エタノール50%水溶液でもうまくいく気がします。
メタノール炎は無色であることが多く見えづらいので、メタノールにあらかじめ食塩などを添加しておいて炎色反応を併用するとよいようです。
メタノール以外にエタノールでも試してみましたが、熱さを感じました。エタノール単独で行うのは避けたほうが良いです。


2)指5本で指マッチ
指一本でできるなら片手の指全部で同時にやれば5倍派手になるじゃないか。というわけで5本です。それぞれの指はひらいたままで、独立にしておきます。指ごとに炎色反応の色を変えるなんてこともできます。指同士が近くなると、熱さを感じるかもしれませんので注意して下さい。


3)両手マッチ

  • バットにメタノールを用意する。念のため、消火用の水もバケツかバットに用意しておく。
  • 両手に軍手をはめる。軍手は吸収性の素材のものを使います。
  • 両手を軍手ごと手首までひたす。
  • 両手に着火し、上に向ける。
  • 消火の際は水に手をひたす。

もはやマッチという趣ではなく、たいまつに近いですが。両手から炎が立ち上ります。派手です。
よく燃えますが、燃焼のために軍手表面にメタノールが供給される限り、手は熱くなりません。結構長持ちしますよ。異変を感じたら消火します。リボーンごっこやゲームセンターあらしごっこができそうですが、危険かもしれません。

シャンプーを薄めてはいけない4つの理由


福留さんがシャンプーを「シャンプーを3倍に薄めて使うだけでのも環境破壊を遅らせることがでるのです。」などと言ってるので*1、薄めてはいけない理由をあげてみる。

  • 手にとったときにこぼれる

市販のシャンプーは扱いやすいようにわざとある程度の粘度が付与してあります。もしシャンプーが水のように低粘度であればうまく手に適量を保持することができず、手からこぼれる量が増えて結局は無駄になってしまう量が増えるでしょう。ポンプ式の場合だと、粘度が低い場合には勢い良く出すぎてうまく手にとれないこともあります。 シャンプーを水で薄めてしまうと粘度が低下して取り扱いやすさが低下するのでこのような無駄が増えます。

  • 分離する

一部の成分は分離するかもしれません。たとえば、もともと透明なシャンプーの外観に光沢感を付与するために脂肪酸グリコールエステルなどの微結晶が用いられたりします。この微結晶は、シャンプーと同じ比重のものを使うことで浮いたり沈んだりするのを防いでいます。比重が高ければ沈んでしまい、低ければ浮いてしまうのでちょうどいい比重に調整しているのです。
水で希釈するとシャンプーの比重が変化するので、これらの成分が沈降(もしくは浮上?)してしまいます。また、水で希釈することによる粘度低下もこの沈降(浮上?)速度を早めます。

  • 効果が落ちる

リンスインシャンプーやコンディショニング効果の高いシャンプーには、コンディショニング成分としてカチオン化ポリマーが含まれていることが多いです。これはまわりの界面活性剤濃度が減少すると析出してきて不溶化するという便利な性質を持っています。つまり、シャンプー中ではよく溶けているのですが、シャンプーを洗い流す際には析出してきて髪に付着し、コンディショニング効果を付与する、といったことが可能になるのです。これがリンスインシャンプーの基本的な原理ですね。
このような成分は洗い流すときに析出・付着するように設計されているので、薄めたまま保存すると髪の毛ではなく容器で析出してしまうかもしれません。そうするともちろんコンディショニング効果は低下します。

  • 微生物が増える。

シャンプーを薄めてはいけない最大の理由がこれです。浴場は高温多湿の環境で、微生物が増えやすい状態です。市販のシャンプーは使用環境での防腐を考慮してつくられており、必要最低限の防腐剤かもしくは防腐効果のあるものが含まれています。
シャンプーを水で薄めた場合、これらの防腐効果を持った成分が希釈され、また水分量も増えるために微生物が増えやすい環境になってしまいます。
薄めたシャンプーを使っていていつもと違う臭いがしたら、そのシャンプーはおそらく微生物に汚染されています。

シャンプーの成分を見て安全とか危険とかほとんど意味無い

シャンプーや化粧品の全成分を表示を見て、どの成分は安全だとかどの成分が危険だとか、そんなこと書いてるブログやサイトや本がたくさんありますよね。でも、ほとんど意味はありません。
だって、彼らは量的概念がすっかり欠落しているから。パラケルススが言ったように「毒かどうかは用量による」のですが、彼らは用量を考慮していません。

そこで、ここではシャンプーを例にどのように量的評価が行われているかを説明してみます。


まず、全身毒性(systemic toxicity)ですが、欧州で安全性の評価を行っている科学委員会が採用している数値を採用します。消費者製品の科学委員会によれば、シャンプーの場合、一日使用量は8g、また、リテンションファクター(残留ファクター)は0.01とされているので、80mgが残留することになります*1。ここで、成分Aがシャンプー中に1%含まれているとすると、成分Aは800μgが残留していることになります。経皮吸収率等のデータがあればそれを用いますが、ない場合は100%として、最大800μgが体内に吸収されると考えます。体重50kgのヒトの場合は、16μg/kgの体内負荷量となります。
この体内負荷量と、動物実験等から求めたNOAEL(最大無毒性量)と比較し、安全係数を考慮してたとえば100倍以上であれば安全だと見なすわけです。この場合だと、安全係数を100とすると、NOAELが1.6mg/kg以上であれば安全とみなせます。この値は非常に小さく、少なくとも、毒物とされる成分がシャンプーに1%以上含まれていない限り、考慮に入りません。ちなみに経皮では、LD50が200mg/Kg以下がおおむね毒物に指定されることになっているので大きな差がありますね。
経皮毒という用語を作って、界面活性剤は経皮吸収が増加するから危険といってる人たちもいますが、100%吸収するとしても微小な量なのでほとんど懸念にはなりません。


次は局所毒性(local toxicity)ですが、これは皮膚刺激と皮膚感作性(アレルギー性接触皮膚炎)を考慮しないといけません。皮膚刺激に関しては、細胞毒性試験などのスクリーニング試験もありますが、最終的にはヒト臨床試験で安全性が確認されます。シャンプーであれば、実使用時には1/100以下に希釈されており、しかも短時間の接触になります。
アレルギーの懸念があるからこの成分は危険、という人もそれなりにいます。彼らはもしかしたら誤解しているかもしれませんが、アレルギー性接触皮膚炎も、「毒かどうかは用量による」のです。アレルギー性接触皮膚炎も、用量反応曲線が作成できるのです*2。それゆえに、ある濃度以下であれば安全に使用できるという濃度が決定できるのです。実際には、ヒトのデータ、もしくは動物実験から「皮膚の単位面積あたりの用量」を算出し、必要ならば安全係数をかけて評価します。たとえば香料に関しては、IFRA(International Fragrance Association)が基準を作成しており、単位面積あたりの用量を基準としてこの濃度以下であれば安全に使用できるという基準を定めています。また、防腐剤も皮膚感作性を有していることが多いのですが、日本においてはポジティブリストによって皮膚感作を生じないように濃度が設定されています。
ちなみに、シャンプーにおける一般消費者のアレルギー性接触皮膚炎は、極めてまれで症例報告も数えるほどしかありません。低濃度かつ短時間の接触なので、頻度が低いのです。


量的概念が欠落している「ある成分は危険である」、といった言説は意味がありません。

追記:毒物云々はさっぱり意味が無かったので削除しました。急性毒性と比較することに意味がないので・・。

*1:http://ec.europa.eu/health/ph_risk/committees/04_sccp/docs/sccp_o_03j.pdf

*2:たとえばニッケルに関して http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15725281

酪酸は水生生物に有害だけど酢酸のほうが有害で石けんのほうがもっと有害

エコテロは許せないが量や有害性の強弱などの概念が必要だと思うので簡単に。


酪酸が水生生物に有害という根拠はオオミジンコに対する遊泳阻害で、48hでの曝露では61mg/Lの曝露で半数の遊泳阻害が見られたと報告されています。一方、酢酸では24hでEC=47mg/Lです。同じエンドポイントに対して、酢酸のほうが短い時間・低濃度で有害性が見られているので、酢酸のほうが有害性が高いです。
また、GHS分類によれば、酪酸の水生環境急性有害性・慢性有害性はそれぞれ区分3、区分外です。一方、ステアリン酸ナトリウムでは、急性・慢性とも区分2なので、ステアリン酸ナトリウムのほうが有害です。
ちなみにGHSでは有害なほうから区分1,2・・としています。有害でないものは区分外となります。


以下参考URL
http://www.safe.nite.go.jp/ghs/0817.html
http://www.jaish.gr.jp/anzen/gmsds/107-92-6.html
http://www.safe.nite.go.jp/ghs/0724.html

毒性がわからなくても極微量なら安全

農薬ポジティブリスト制度の一律基準の値(0.01ppm)がどうやって決定されたか、あまり知られていないようです。
http://www.nikkeibp.co.jp/article/sj/20100126/207184/?P=5 からの引用です。

――農薬や飼料添加物などで「個別に残留基準が定められてない」ものに対し、絶対に安全量としてもっとも厳しい値である0.01ppmに決められたものですね。

唐木 この0.01ppmという一律基準は異常な厳しさで、隣の畑で撒いた農薬が風で流れてきて野菜に付いただけでも基準違反になる。これを科学的根拠に基づいた正常な基準値に、早く改める必要がある。

この0.01ppmという基準は「毒性学的懸念閾値」という概念を用いて算出されているものです。科学的根拠が無いというわけではありません。


わたしたちは数万〜数十万の化学物質に囲まれて生活しています。分析技術の発展に伴って、様々な化学物質があらゆるとことから、水道水中や血液中からも合成化学物質が検出されるようになりました。しかし、全ての化学物質について毒性データが完全に揃っているわけではありません。では、全ての化学物質について毒性データが必要なのでしょうか。毒性学者は、それは必要ではないと考えました。


「新規の化学物質でも、既知の化学物質と比べて毒性が大幅に変わるわけではない。既知の化学物質について、毒性の分布がわかれば、確率的に毒性の強さは予想できる。」
「じゃあ微量だったら問題ないと言えるんじゃないか。」
「問題無いものを、お金や時間や動物を使用して試験するの無駄だ。」
「試験せずに済めば、もっと優先順位の高いものにリソースを振り分けられる。」
「でもそれを行うためには、これくらいだったら安全、という量を科学的に決定して、行政に受け入れてもらわないといけない。」
「じゃあ検討しよう。」


ということで生まれた概念が、「毒性学的懸念閾値」です。


まず、発がん性物質について検討されました。344 種の化学物質について、げっ歯類の発がん性試験のデータを用いて、ヒトで一生涯摂取しても発がんリスクが100万人に一人となる量が求められました。その結果、ある化学物質を摂取したときに一人当たり0.15μg/day以下の摂取であれば、発がんリスクは100万人に一人以下となる確率が86%であるとされました*1。
さらに、化学物質といっても発がん性物質ばかりではないことが考慮されました。全化学物質における発がん性物質の割合を10%とすると、ある化学物質の摂取量が1.5μg/day以下であれば発がんリスクが100万人に一人以下となる確率が96%であることが示され*2、1.5μg/dayが基準として採用されました。
毒性は、発がん性だけではありません。そこで神経毒性・発達毒性等の他のエンドポイントについても同様の調査がなされました。その結果、これらのエンドポイントは発がん性よりも感度が低く、1.5μg/dayを基準としている限りでは安全であることが示されました。


このようにして得られた1.5μg/dayという基準は、既に日米欧の規制当局で採用されています。
例えば、医薬品中の遺伝毒性不純物(発がん性が懸念される)について、EMEA(欧州医薬品庁)では1.5μg/day以下であれば毒性評価の必要はないとしています。本来ならば発がん性がある恐れが高いので0.15μg/dayが採用されるところなんですが、医薬品はベネフィットが大きいから、という理由でこの場合では10倍高いリスクが許容されています。
米国においては、FDAが食品包装容器からの溶出に関して、食品中0.5ppb以下であれば評価の必要が無いとしています。食品の場合、一日摂取量は水と食品合わせて3000g/dayが計算に用いられますが、3000g/day×0.5ppb = 1.5μg/day から0.5ppbが決められました。
日本では、残留農薬に関するポジティブリスト一律基準で0.01ppmが設定されていますが、これも農作物の一日摂取量が米を除いて150g/dayを越えないことから、150g/day × 0.01ppm = 1.5μg/day となるように設定された値です。だから「詳細な毒性がわからなくても、0.01ppm以下の残留農薬は安全」と言えるのです。


現在ではさらに拡張されています。
900 以上の化学物質について化学構造式からおおまかに低毒性〜高毒性と3つに分けることを行い(cramer classによる分類)、それぞれのクラスについて無影響量(動物実験で摂取による影響が見られなかった量)の分布とさらに安全係数100を適用した TDIの分布を求めました。この結果をもとに、「摂取量がこの量以下であれば95%の確率でTDIを越えない」とされる量がそれぞれ90, 540, 1800μg/dayと決定されました*3。
この値はJECFAや食品安全委員会での食品香料評価で使用されています。香料の場合は、微量摂取であることと、よく似た構造のものがたくさんあるためにこのような評価がなされています。


曝露量が十分に小さいものについては、未知だから危険だとか、毒性データが揃ってないから危険というわけではないのです。毒性学的懸念閾値は、微量であれば毒性を評価する必要は無いとする、不必要な試験を避ける優れた概念です。

*1:http://www.inchem.org/documents/jecfa/jecmono/v040je17.htm のFig4とか。

*2:上述のTable3

*3:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14630131 などを参照

遺伝毒性

前回の続きです。Wikipediaの「変異原」がつっこみどころ満載なので書いておく。本当のことを言うとWikipediaは用語が無茶苦茶なので何を言っているのかほとんど理解できないんだ。

つまり変異原性を原因とする遺伝形質の変化(発がん、催奇形性)は毒性としてとして認識されれば遺伝毒性と呼ばれる。また、変異原性を原因とする形質の変化が生殖機能に影響する場合や次世代の形質転換に及ぶ場合は生殖毒性と呼ばれる。

呼ばないから。発がんが起こらなくても遺伝毒性は確認できるから。DNAアダクトの検出やコメットアッセイなどでDNA断片化の検出を行えばいいし、末梢血中リンパ球の染色体異常の頻度を測定することなどでも遺伝毒性は検出できる。いくらでも測定方法あるぞ。
また、生殖毒性とは基本関係無いです。たとえば、ダイオキシンやサリドマイド、フタル酸エステルは催奇形性・生殖毒性で知られてますが遺伝毒性はありませんね。生殖毒性の原因は多岐にわたるので、そのうちの原因として遺伝毒性が関わるということはあります。しかし、生殖毒性と遺伝毒性に何らかの相関が見られるわけではなく、関係無いことが大多数です。催奇形性についても同様です。

変異原性の存在は常に発がん性を始めとした遺伝毒性を有することを意味せず、遺伝毒性を判定するには発がん性を始めとした遺伝毒性試験(遺伝子突然変異試験と染色体突然変異試験)が必要である[3]。すなわち、変異原性試験はプロセスが簡便なため、遺伝毒性試験の前スクリーニング(絞り込みスクリーニング)として実施されるため一連の遺伝毒性試験に含まれる場合がある。しかし変異原性試験の結果のみでは遺伝毒性試験の代用にはならない。

まず、発がん性試験は遺伝毒性試験ではないですね。関連性は深いですが、別の概念でエンドポイントが全然違うし、遺伝毒性があるが発がんしないもの、遺伝毒性があるが発がんがおこるものなどがあります。たとえばダイオキシンは、遺伝毒性が認められない発がん物質ですね。
また、変異原性試験はプロセスが簡便というわけではありません。GHS分類の生殖細胞変異原性の分類では、参照する試験としてげっ歯類を用いる優性致死試験、マウスを用いる相互転座試験などがあげられてますが、これらは別に簡便じゃないですよ。
遺伝毒性試験は、ヒトでの遺伝毒性を生じる物質を検出することを目的として、種々のものが開発されています。文献によれば100以上あるらしいです。遺伝毒性は単一の試験系では十分に評価できないため、複数の試験を組み合わせて評価する戦略が必要になってきます。医薬品や農薬等の申請ではガイドラインを設けて、そのガイドラインに沿った複数の試験が必要とされます。


Wikipediaの試験法の分類も無茶苦茶で、形質転換試験は遺伝毒性試験じゃねーよとか、姉妹染色分体交換は染色体異常じゃねーよとかいろいろ突っ込めそうです。