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Accelerating ScienceLearning at the Bench / 分子生物学実験関連 / 【リアルタイムPCRユーザー必見】プライマーダイマーを減らすSYBR Greenマスターミックスとは?

【リアルタイムPCRユーザー必見】プライマーダイマーを減らすSYBR Greenマスターミックスとは?

Written by LATB Staff | Published: 08.07.2020

▼もくじ

  • リアルタイムPCRの解離曲線でみられる問題点
  • PowerUp SYBR Green Master Mixの特徴とは?
  • 「見える」マスターミックスがピペッティングエラーを低減 着実に実験を進めるためのPowerTrack SYBR Green Master Mix の特徴とは?
  • リアルタイムPCRハンドブック 無料ダウンロード
  • リアルタイムPCRトラブルシューティング 無料ダウンロード

リアルタイムPCRの解離曲線でみられる問題点

みなさんは、リアルタイムPCR (qPCR )の解離曲線(融解曲線)において、複数のピークを目にしたことがあるでしょうか? 下図は、一般的なSYBR Greenマスターミックスによって得られた解離曲線データです。

ご覧のとおり、ターゲットの86.7℃のメインピークのほかに複数のピークが確認できます。

 

しかし、ここで結果として見えてほしいのは、DNA由来増幅産物から得られる“ひとつの明確なピーク”です。なぜなら、qPCRの解離曲線において複数のピークが観察されるということは、2つ以上の目的以外のPCR産物が増幅されたことを示唆するからです。

※詳細については、3分で分かる動画も公開していますので、ぜひご覧ください。

では、そもそもなぜ目的以外の増幅が生じてしまったのでしょうか?

考えられる主な要因として、以下の2点が挙げられます。

  1. プライマーの非特異的な結合
  2. プライマーダイマー等の形成

対処方法には、温度条件変更やプライマーの再設計などいくつか対処方法がありますが、反応系の最適化に多くの時間や手間を要します。そこで今回は目的外の増幅を抑えることができる、新型のSYBRベースマスターミックス、Applied Biosystems™ PowerUp™ SYBR™ Green Master Mixについて紹介します。

 

PowerUp SYBR Green Master Mixの特徴とは?

下図はPowerUp SYBR Green Master Mixと他社製品について、非特異的な増幅であるプライマーダイマー等の形成に着目し、性能を比較した結果です。テンプレートDNAを含まない状態でqPCRを行ったところ、他社製品(他社ミックスT1&T2)では高確率でプライマーダイマー由来と考えられる増幅が生じていますが、PowerUp SYBR Green Master Mixではほとんど目的以外の産物が検出されませんでした。

このことから、PowerUp SYBR Green Master Mixはプライマーダイマー等由来の非特異的増幅を防ぐのに適したマスターミックスだといえるでしょう。他にも、特徴的な機能がありますので、詳細はこちらをご覧ください。

  • 28種のプライマーセットを使用し、テンプレートDNAの代わりにNuclease Free Waterを添加し測定(n=3)
  • 増幅したウェルの陽性率およびCt値を算出し評価
  • Ct値が低いほど増幅が早く実際の定量値に影響を与えやすい

「見える」マスターミックスがピペッティングエラーを低減 着実に実験を進めるためのPowerTrack SYBR Green Master Mix の特徴とは?

当社には他にも特徴あるSYBRマスターミックスがございます。Applied Biosystems™ PowerTrack™ SYBR™ Green Master Mix には、どのウェルまでピペッティング操作を行ったかを可視化する 2色のトラッキング用色素が含まれています。マスターミックスに青色の色素が、サンプルバッファに黄色の色素がついており、混ざると緑色に変化するため、添加時の操作を目視で確認でき、入れ忘れや入れ間違い等の操作エラーを最小限に抑えます。

リアルタイムPCRハンドブック 無料ダウンロード

このハンドブックでは、リアルタイムPCRの理論や実験デザインの設計など、リアルタイムPCRの基礎知識が掲載されています。リアルタイムPCRを始めたばかりの方やこれから実験を考えている方にうってつけのハンドブックです。PDFファイルのダウンロードをご希望の方は、下記ボタンよりお申し込みください。

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リアルタイムPCRトラブルシューティング 無料ダウンロード

異常なS字状の増幅曲線、NTCでの増幅検出、増幅が見られないなど、リアルタイムPCRの実験中に困った際の手助けになる情報を紹介しています。PDFファイルのダウンロードをご希望の方は、下記ボタンよりお申し込みください。

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研究用にのみ使用できます。診断用には使用いただけません。

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