Интервью с Амусой Буминасан об аллотопической экспрессии генов

Мы взяли интервью у доктора Амусы Буминасан из SENS Research Foundation на конференции Ending Age-Related Diseases 2019 о ее исследованиях по восстановительной терапии митохондрий, значимости экспериментов на модельных животных и ее взглядах на будущее изучения процессов старения.

Доктор Амуса Буминасан получила степени магистра и PhD по биохимии в University of Pune и National Chemical Laboratory в Индии соответственно. Она продолжила исследовать митохондрии в University of Pennsylvania и Rutgers University в США. Она подробно изучила механизмы слияния и деления у митохондрий, биосинтеза железно серных кластеров и доставку белков в митохондрии в рамках своей постдоковской стажировки в American Heart Association.

В настоящее время Амуса возглавляет программу MitoSENS в Маунтин Вью, Калифорния. Её исследовательская группа занимается изучением мутаций митохондриальной ДНК (мтДНК) и разработкой методов восстановления функциональности, утраченной в результате этих мутаций, путём аллотопической экспрессии митохондриальных генов. Наследственные мутации мтДНК могут приводить к тяжёлым и изнурительным заболеваниям, таким как НАРП, синдром Лея и МЕЛАС.

Используя свои технологии, команда MitoSENS уже преуспела в стабильной экспрессии гена ATP8, и с нетерпением ждёт возможности повторить успех для всех 13-ти генов в ближайшее время. Их цель – разработать безопасную и эффективную генную терапию для лечения митохондриальной дисфункции.

Интервью

Томас Уорнер Ленер: Ваша исследовательская группа начала разработку усовершенствованного метода аллотопической экспрессии мтДНК в 2015 году, и он уже показал весьма многообещающие результаты. Какие препятствия для аллотопической экспрессии преодолевает этот новый метод и что, по вашему мнению, это означает для дальнейших исследований на модельных животных?

Амуса Буминасан: Главное препятствие, которое было преодолено – мы, по крайней мере, экспрессировали все 13 генов. Мы использовали единый подход, чтобы внести некоторые серьёзные поправки во все 13 генов, но этот подход может работать по-разному у них. Возможно, нам придётся перепроектировать указанный подход для каждого гена из-за их особенностей.

Итак, все 13 генов различаются по длине, гидрофобности и комплексам, на которые они нацелены. Основным препятствием является фактор гидрофобности. Белки покрывают внутреннюю мембрану митохондрии в несколько слоёв, и нужно получить их с внешней стороны. Эти 13 белков синтезируются в матриксе, и встраиваются в свои комплексы. Но при аллотопической экспрессии они синтезируются в цитозоле и должны пройти через две мембраны, а затем попасть в нужное место. Митохондрия сама по себе имеет транслоказы (энзимы, катализирующие перенос ионов или молекул через мембраны) наружной и внутренней мембраны, которые работают по-разному. В зависимости от пункта назначения, будут задействованы разные механизмы.

Мы должны разрабатывать белки последовательно, один за другим, или изменить каждый из них так, чтобы они распознавали и задействовали правильный путь. Мы внесём общие поправки во все 13 генов, и, кроме того, мы внесём персональные поправки в каждый из них, чтобы сделать их функциональными. Первый шаг – хотя бы увидеть результат – и этот шаг выполнен.

Томас Уорнер Ленер: Какими критериями руководствовался MitoSENS, выбирая гены для работы над аллотопической экспрессией?

Амуса Буминасан: Одним из препятствий является проверка того, что наша технология реально работает, и для этого нам нужны модельные системы. Причина, позволившая нам показать, что ATP8 работает – наличие клеточной линии пациента с серьёзной мутацией, нулевой для ATP8. Мутации мтДНК у людей проявляются на разных уровнях, но довольно необычно чтобы у пациента полностью отсутствовал некий белок. Это редкое событие. Но митохондриальная ДНК существует в гетероплазмии. Соотношение мутантных и нормальных митохондрий это фактор, определяющий фенотип заболевания. Или же заболевание сдерживается, за счёт того, что нормальные мтДНК подавляют мутантные ДНК.

Одна из причин, по которой мы убедились в корректной работе ATP8, заключается в том, что нам удалось получить нулевую клеточную линию и показать, что экзогенный белок попадает в нужное место и восстанавливает многие из её функций. По сути, нам доступна нужная клеточная линия – редкая удача. Что же, почему не воспользоваться этим?

Томас Уорнер Ленер: В обзоре, опубликованном в апреле этого года группой китайских учёных, обсуждались преимущества использования мух Drosophila в качестве модели для изучения мутаций мтДНК. Можете ли вы объяснить, почему группа MitoSENS предпочитает проводить свои исследования на мышах, а не на мухах?

Амуса Буминасан: Как мы узнали на этой конференции, мухи, на биохимическом уровне, позволяют убедиться в работоспособности определённых методов, но вам нужны высшие млекопитающие, чтобы перейти к клиническим испытаниям на человеке. Опять же, так получилось, что у нас есть модель мышиной болезни для гена ATP8. Это очень хорошая модель без нулевой мутации; белок всё ещё в наличии, но это низко-функциональный белок.

Симптомы болезни лёгкие, но очень важные. Они характерны для диабета или инсулинорезистентности. С поведенческой точки зрения, мыши не стрессоустойчивы. Благодаря этому, если аллотопический ATP8 сработает и если мы сможем синтезировать его в клеточном ядре мыши и восстановить его функции, то легко сможем продемонстрировать, что состояние организма вернулось в норму, как с биохимической, так и с поведенческой точки зрения. Вот почему мы предпочитаем мышь в качестве модельного животного.

Томас Уорнер Ленер: Почему именно разработка и использование Maximally Modifiable Mouse – это значительный шаг в разработке омолаживающей терапии?

Амуса Буминасан: Как вы знаете, SENS финансирует Maximally Modifiable Mouse. В настоящий момент генную терапию обычно проводят при помощи векторов аденоассоциированных вирусов, их терапия является временной. Даже сейчас Доктор Бласко подтвердил это. Есть свои преимущества в том, что эффект временный – он как бы ослабевает во времени. Но в контексте аллотопической экспрессии мы хотели бы, чтобы эффект был стабильным и перманентным. Благодаря Maximally Modifiable Mouse мы можем поместить в геном целые гены. Используя аденоассоциированные вирусы, вы ограничены полезной нагрузкой, которую вы сможете внести геном. А наша цель – со временем внести все 13 генов в геном. Это высокая планка, но именно её мы и хотим достичь.

Чтобы добиться этого, мы создали Maximally Modifiable Mouse, для того чтобы поместить в неё хотя бы один ген. Мы хотим, в дальнейшем, поместить в её геном прочие гены, чтобы их транскрипция и трансляция контролировались так же, как контролируются иные митохондриальные гены, находящиеся в ядре. Лучше всего для этого подходит Maximally Modifiable Mouse.

Томас Уорнер Ленер: Альтернативой аллотопической экспрессии является ксенотропная экспрессия белков других видов, функционирующих схожим образом. Пример успешной ксенотропной экспрессии был показан в альтернативной оксидазе асцидии, которая полностью восстановила жизнеспособность некоторых мутировавших дрозофил. Не могли бы вы сказать, какие преимущества имеет аллотопическая экспрессия в сравнении с ксенотропной экспрессией, когда речь идёт про применение терапии у людей.

Амуса Буминасан: Мы хотим, чтобы это было как можно более гуманизированным. Эти гены и так чужие в ядерном геноме. Возможно, вы уже ввели новые иммунные профили, которые генерирует этот чужой ген. Теперь, если вы хотите использовать ксенотропную экспрессию, это внесёт ещё больше изменений. С точки зрения тестирования, нам придётся проверять все гены иных организмов, которые попали в ядро. Мы можем внести эти изменения, но мы хотим, чтобы изменения были как можно более гуманизированными.

Многие из этих генов, мигрируя в ядро в ходе эволюции, приобрели различные изменения, позволившие им трансформироваться. У некоторых животных Complex I функционирует благодаря всего одному белку, например NDI1 в дрожжах. Но в человеческой клетке для его функционирования нужно 47 белков, 7 из них синтезируются из митохондиральной ДНК, а прочие 40 – из ядерной ДНК.

Вы не захотите экспрессировать чужеродный белок (NDI1), а затем пытаться восстановить его функциональность. С чисто экспериментальной точки зрения вы сможете это сделать, но использовать это в качестве терапии у людей – не лучшая идея, если вы хотите сохранить целостность всего биохимического комплекса. Я даже не могу представить, какие сложности могут возникнуть в процессе. Генная терапия сама по себе сложна, а теперь представьте генную терапию чем-то вроде гена из дрожжей.

Томас Уорнер Ленер: Какие реалистичные сроки появления человеческой терапии вы могли бы назвать?

Амуса Буминасан: На самом деле, эта терапия уже существует, но для перекодированной версии. То есть, у нас уже есть прецедент. Всё что нам нужно – это показать, что наша версия лучше и имеет лучший иммунный профиль. Вот почему мы хотим сделать это на модельных животных – чтобы показать, насколько она лучше. Я не могу назвать сроки – это очень сложный вопрос. Во время конференции кто-то уже спросил меня. Если исследования на животных пройдут хорошо – то пять лет. Не пять лет до человеческой терапии, а пять лет чтобы показать, что метод вполне хорош, чтобы начать разработку человеческой терапии на его основе.

Томас Уорнер Ленер: Существует несколько факторов, располагающих к накоплению мутаций в мтДНК со временем. Нужно ли дополнить аллотопическую экспрессию генов мтДНК иными терапиями, которые сократят количество мутаций, возникающих со временем, чтобы увидеть заметный эффект в старении?

Амуса Буминасан: Хороший вопрос. Если вы дополните аллотопическую экспрессию тем, что есть уже сейчас, например идебеноном, эламипретидом или чем-либо похожим – это будет полезно. Все они являются антиоксидантами и улучшают функцию окислительного фосфорилирования.

Однако, речь идёт о генной терапии у пациентов, их болезнь может не способствовать принятию этой терапии. Их биохимический комплекс не полностью функционален, но дополняющая терапия воздействует лишь на часть каскада, в то время как митохондрии в целом функционируют не так, как нужно. Возможно, вы захотите исправить их болезнь до определённого уровня, и только после этого применить генную терапию, чтобы убедиться, что генная терапия работает.

Что касается старения – спорный вопрос, является ли мутации мтДНК основным фактором старения или нет. Наша цель – помочь пациентам и, если это удастся, пойти дальше.

Томас Уорнер Ленер: Какие, по вашему мнению, исследования в омолаживающей биотехнологии наиболее нужны сейчас, чтобы максимально продвинуться в этой сфере в ближайшие 10 лет?

Амуса Буминасан: Я думаю, нам нужны хорошие биомаркеры. Это то, чего не хватает в сфере. Все хотят быстрых исправлений. Есть различные сферы исследования, и каждый исследователь считает важной для борьбы со старением свою, но я не думаю, что все они правы. Я думаю, старение больше похоже на распад всего комплекса со временем. Поэтому нам нужны лучшие маркеры и, возможно, лучшее понимание того, что значит быть здоровым (в преклонном возрасте). Люди не должны мириться с тем, что с возрастом они будут стареть, а затем умрут. Возможно, нужно привлечь публичное внимание к проблеме, чтобы люди поняли, что это нормально – желать и иметь возможность быть здоровым в течении всей жизни.

Томас Уорнер Ленер: Какой вопрос, из тех, что вам ещё ни разу не задавали, вы бы хотели услышать от журналистов?

Амуса Буминасан: Это неожиданно сложный вопрос. Я не могу ответить на него прямо сейчас. Однако я хочу сказать кое-что о MitoMouse. От лица MitoTeam в SENS я хочу выразить благодарность LEAF за помощь.


Перевёл Владислав Дженджера, группа SENS Volunteers