Este flujo de trabajo realiza la identificación conjunta de variantes germinales a partir de archivos de secuenciación masiva (WGS/WES).

NOTA:

• Por el momento el análisis sólo está disponible para datos ilummina paired-end en humano.
• Si se desea otra especie revisar el flujo identificación conjunta de variantes germinales a partir de datos WGS/WES con bootstrapping. Este flujo se provee como parte de este repositorio pero no ha sido probado por personal del INMEGEN en otras especies.

Para solicitar este flujo de trabajo como servicio debes de entregar al personal de INMEGEN:

• Archivos de secuenciación FASTQ (Illumina paired-end)
• Archivo con la información experimental (vease la sección: Formato del archivo sample_info)
• En caso de WES especificar el kit utilizado

Los archivos que necesitas se describen en el apartando "Solicitud de servicio".

Antes de correr este pipeline asegúrate de contar con las siguientes herramientas y archivos:

1. Clonar el repositorio principal siguiendo las instrucciones:

    git clone https://github.com/INMEGEN/Pipelines_INMEGEN.git
   

2. Verifica si tienes las siguientes herramientas informáticas:

   • NextFlow (versión mayor o gual a 22.10.7)

   • Docker (versión mayor o gual a 23.0.5)

   • Imagen de docker pipelinesinmegen/pipelines_inmegen:public, la puedes descargar con el comando:

     docker pull pipelinesinmegen/pipelines_inmegen:public
     

3. Asegurarse de contar con los siguientes archivos, necesarios para el pipeline:

   • Genoma hg38
   • Índice del genoma de referencia (generado con SAMTOOLS faidx)
   • Índice de BWA
   • Archivos de recalibración de BQSR y VQSR

NOTA: Todos estos archivos se pueden descargar del bundle de GATK.

Se recomienda que todos estos archivos se encuentren en el mismo directorio.

Para correr este pipeline sigue las siguientes instrucciones:

1. Completar el archivo sample_info.tsv con la información que se describe en la sección Formato del archivo sample_info

2. Editar el archivo de nextflow.config con la siguiente información:

   • Ruta absoluta del directorio de salida de nextflow (params.outdir)
   • Ruta del archivo sample_info.tsv (params.sample_info)
   • Ruta absoluta de los archivos fastq (params.reads)
   • Nombre del proyecto (params.project_name)
   • Si son múltiples lanes por muestra habilitar la ópción a true (params.multiple_lanes)
   • Si el tipo de análisis es dirigido o WES mantener esta opción como true en caso de el tipo de archivos sea WGS cambiar a false (params.wes)
   • Ruta absoluta de la ubicación del índice de BWA del genoma de referencia (params.refdir)
   • Nombre del genoma de referencia sin la ruta absoluta, incluyendo la extensión FASTA p.j. Genoma_hg38.fasta, Genoma_hg19.fa, etc. (params.refname)
   • Ruta absoluta del archivo interval_list, en el caso de WES se puede utilizar el archivo BED del kit para generarlo, para más información consulta la siguiente liga (params.interval_list)
   • Nombre del archivo interval_list (params.intervalname)
   • Ruta absoluta del archivo BED utilizado para la secuenciación (params.bed_file)
   • Ruta absoluta del archivo BED utilizado para la secuenciación que incluye una ventana de 100 bases (params.bed_filew)
   • Ruta absoluta del archivo FASTA con la lista de adaptadores para Trimmomatic
   • Número de núcleos que utilizarán los procesos multi-threading (params.ncrs)
   • En los parámetros para docker, se puede modificar el apartado runOptions la opción --cpus = Número máximo de núcleos por proceso.
   • En los parámetros de Nextflow (executor) solo se puede cambiar la opción queueSize = Número máximo de procesos que se ejecutarán de forma simultánea

Para opciones de configuración específicas para tu servidor o cluster puedes consultar la siguiente liga

NOTA: El número máximo de procesadores que utilizará tu corrida es: cpus * queueSize. Esto aplica en el caso de los procesos que permitan multi-threading.

NOTA: En el caso de WGS el bundle de GATK proveé un archivo interval_list para optimizar el tiempo de ejecución. Se puede utilizar para crear un archivo BED de WGS. En caso de WGS utilizar el mismo archivo BED en las opciones.

NOTA: Los archivos sample_info.tsv y nextflow.config deben encontrarse en el mismo directorio que el archivo main.nf.

3. Ejecutar el comando:

bash run_nextflow.sh /path/to/out/dir

El archivo sample_info.tsv ubicado en la carpeta VC-Germline es indispensable y debe incluir la siguiente información por columna.

• SampleID = Nombre de la muestra secuenciada. Se recomienda el formato [identificador_numeroDeMuestra]
• Sample_name = Nombre que identifica a la muestra. Se debe utilizar el formato [SampleID_numeroDeLane]. Sólo en el caso de que una muestra se encuentra únicamente en UN LANE, el campo SampleID debe ser igual al campo Sample_name
• RG_PU = Campo PU del Read Group (@RG) de la muestra, está asociado al barcode de la flowcell y al número de lane. Se debe utilizar el formato [flowcell.númeroDeLane]
• RG_PL = Campo PL del Read Group (@RG) de la muestra, está asociado a la tenología de secuenciación ej. ILLUMINA, SOLID, LS454, HELICOS y PACBIO
• RG_LB = Campo PU del Read Group (@RG) de la muestra, está asociado al barcode de la librería de secuenciación
• R1 = Ruta absoluta del archivo fastq R1 (forward)
• R2 = Ruta absoluta del archivo fastq R2 (reverse)

Para entender el significado de los campos del Read Group (@RG = etiqueta que indentifica a cada muestra) y como obtener la información para los campos RG_PU, RG_PL y RG_LB revisa la siguiente liga.

Recuerda:

• Utilizar letras de la A a la Z (mayúsculas y minúsculas sin aceltos)
• No utilizar la letra "ñ"
• Sólo emplear los siguientes caracterez especiales (guión -, guión bajo _, punto .)
• No están permitidos los espacios

A continuación, se muestran algunos ejemplos de cómo rellenar el contenido del archivo sample_info.tsv.

Ejemplo 1, muestras con múltiples lanes:

SampleID	Sample_name	RG_PU	RG_PL	RG_LB	R1	R2
ID_S001	ID_S001_L001	FLOWCELL.1	ILLUMINA	BARCODE	Path/to/fastq_S001_L001_R1.fq	Path/to/fastq_S001_L001_R2.fq
ID_S001	ID_S001_L002	FLOWCELL.2	ILLUMINA	BARCODE	Path/to/fastq_S001_L002_R1.fq	Path/to/fastq_S001_L002_R2.fq

Ejemplo 2, muestras con un sólo lane:

SampleID	SampleI_name	RG_PU	RG_PL	RG_LB	R1	R2
ID_S1	ID_S1	FLOWCELL.1	ILLUMINA	BARCODE	Path/to/fastq_S1_R1.fastq	Path/to/fastq_S1_R2.fastq
ID_S2	ID_S2	FLOWCELL.1	ILLUMINA	BARCODE	Path/to/fastq_S2_R1.fastq	Path/to/fastq_S2_R2.fastq

Ejemplo 3, en caso de no contar con la información del @RG y sea sólo una muestra por lane:

SampleID	Sample_name	RG_PU	RG_PL	RG_LB	R1	R2
ID_S1	ID_S1	FC00001.1	ILLUMINA	BC0001	Path/to/fastq_R1.fq.gz	Path/to/fastq_R2.fq.gz
ID_S2	ID_S2	FC00001.1	ILLUMINA	BC0001	Path/to/fastq_R1.fastq.gz	Path/to/fastq_R2.fastq.gz

Como se observa no es necesario que el SampleID coincida con el nombre del archivo que se encuentra en los campos R1 y R2.

NOTA IMPORTANTE: Recuerda cada columna del archivo sample_info DEBE estar separada por tabulador (\t) y el encabezado debe de conservarse exactamente igual al archivo muestra sample_info.tsv.

• BCFTools (1.19)
• BWA (0.7.17)
• Fastp (0.23.4)
• FastQC (0.12.1)
• GATK (4.2.6.1)
• Mosdepth (0.3.6)
• MultiQC (1.12)
• Picard Tools (2.27.5)
• R (4.2.3)
• SAMTools (1.12)
• SnpEff (5.2)

Se anexa el siguiente diagrama de flujo con la descripción completa del pipeline ejecutado. Este pipeline está basado en las buenas prácticas de GATK: identificación de variantes germinal de GATK